Bepalingen op het lab, met welk doel? Er zijn twee typen bepalingen op het lab
Gevoeligheidsbepalingen
Bepalingen die de gevoeligheid van een m.o. vaststellen, zodat bekend wordt met welk antibioticum een m.o. te bestijden is en de patiënt dus te genezen is.
Aanwezigheidsbepalingen
Bepalingen om vast te stellen of en hoeveel antibioticum ergens in zit De monsters kunnen zijn:
- Bloed(serum) van een patiënt, met de achterliggende vraag : is er wel genoeg antibioticum aanwezig om het micro-organisme te bestrijden?
- Melk in een zuivelfabriek, met de achterliggende vraag of er antibiotica inzitten, dit mag niet in verband met allergie bij consumenten voor penicilline en omdat de melk ongeschikt is voor de bereiding van kaas en yoghurt..
- Vlees, en andere levensmiddelen, ook hier mogen geen antibiotica in aanwezig zijn.
Voor alle bepalingen geldt dat je er net zo goed andere groeiremmende en bacteriedodende stoffen mee kunt onderzoeken. Dus in plaats van een antibioticum kun je zo ook een conserveermiddel bepalen (in een levensmiddel of je contactlenzenvloeistof) Ook kun van producten die als groeiremmend worden aangeprezen, zoals knoflook, ui, muntgeld , kruiden en Spaanse peper , kun je onderzoeken of deze beweringen kloppen.
De gevoeligheidsbepalingen
Er zijn twee methoden:
De MIC-bepaling en het maken van een antibiogram
De MIC-bepaling
De te onderzoeken bacterie wordt geënt in een serie buizen met voedingsmedia waarin verschillende concentraties van het te onderzoeken antibioticum.
De laagste concentratie die geen groei te zien geeft is de M.I.C. (Minimal Inhibitory Concentration) of M.R.C.(Minimale Remmende Concentratie) van dit middel voor die bacterie.
De concentraties die ingezet moeten worden dienen (zo dicht mogelijk) rond deze waarde te liggen. Gebeurt dit niet dan is geen M.I.C.(of een te onnauwkeurige M.I.C.) af te lezen.
De juiste in te zetten concentraties zijn niet altijd bekend. Het hieronder gegeven voorbeeld kan in de praktijk dus onjuist zijn en dient dan aangepast te worden aan de situatie (bijv. beschikbare literatuurwaarden voor de M.I.C.).
UITVOERING.
Maak van de te onderzoeken stof een concentratiereeks in duplo. Maak hiertoe een stamoplossing van het antibioticum of andere stof bijv. 128 µg/ml. in steriele bouillon van geschikte samenstelling Steriliseer zonodig de oplossing door filtratie.
Maak van deze stamoplossing een 1:1 verdunning met het vloeibare medium door 1 deel stamoplossing bij 1 deel medium te pipetteren.
Herhaal dit een aantal malen tot 12 concentraties (in duplo) zijn bereid.
Beent elke buis met een druppel bacteriesuspensie (d.m.v. een Pasteurpipet).De suspensie is bereid uit een overnachtcultuur en bevat 105 a 106 kve/ml .Neem controles en blanco’s mee.
Incubeer 24 uur bij geschikte temperatuur.
Beoordeel controles en blanco's op respectievelijk aan- en afwezigheid van groei (= troebeling) en zoek de M.I.C. waarde op.
Bij geleidelijke overgangen in groeiremming dient hiervan melding gemaakt te worden. (naar boven)
Het maken van een antibiogram d.m.v. de agardiffusiemethode
Inleiding:
Een antibiogram geeft de gevoeligheid weer van een micro-organisme voor een aantal verschillende potentieel antimicrobe stoffen.
Hiervoor gebruikt men agarplaten waarop het te onderzoeken micro-organisme egaal wordt aangebracht , zodat na incubatie alle kolonies net tegen elkaar zijn gegroeid en er een bacteriedek over de hele plaat is gegroeid.
Voor incubatie brengt men ook de te onderzoeken antibiotica aan. Deze stoffen kunnen in papierschijfjes zijn gedrenkt (waarna de papiertjes gedroogd zijn). Ook kunnen de stoffen in tabletvorm worden opgebracht.
Ook “dingen”kunnen zo onderzocht worden, door ze op de plaat te leggen.
Vervolgens wordt de plaat geïncubeerd.
Voor,maar vooral tijdens de incubatie vinden twee processen plaats:
Groei van de bacterie en Diffusie van de stof.
De stof diffundeert in de agar net zolang totdat de concentratie in de hele plaat hetzelfde is. Voor het zover is zal er een concentratiegradiënt heersen, met een. hoge concentratie rondom de opbrengplaats en steeds lagere concentraties naarmate de afstand tot deze plaats groter wordt. Deze concentraties verschillen per tijdstip.
Na een bepaalde incubatietijd (deze ligt vast) wordt de groei op de plaat beoordeeld en zal er rond een opgebrachte stof al of niet een remzone te zien zijn. Een remzone (hoe klein ook) betekent dat een bacterie gevoelig is voor dat speciale middel. Toch wordt niet elke remzone als gevoelig beoordeeld: de mogelijkheid bestaat dat bij een kleine remzone een heel hoge concentratie antibioticum hoort, zo hoog dat deze concentratie niet bereikt wordt in het bloed van een patiënt of te giftig is in die concentratie.
Er bestaan tabellen die aangeven hoe groot een remzone rond een schijfje met een bepaald middel minstens moet zijn om de bestudeerde bacterie gevoelig voor dat middel te kunnen noemen. Bij kleinere remzone wordt de bacterie ongevoelig of resistent genoemd. Op sommige laboratoria benoemt men de tussenliggende groottes met intermediair.
UITVOERING.
Bereiding van de voedingsbodem.
Bereid en steriliseer een voor dit doel geschikte vaste voedingsbodem volgens de gebruiksaanwijzing. Giet platen met een dikte van overal 4 mm (waterpas) wat correspondeert met 25 ml medium voor schalen met een binnendiameter van 9 cm. De platen moeten voor het enten gedroogd zijn en op kamertemperatuur.
Het maken van het inoculum
Van elke te onderzoeken stam worden 4 kolonies (die van een plaat gehaald worden die 24 uur van te voren beënt is en die bij 37 C is bebroed geweest) in 4 ml Trypton Soya Bouillon geënt.
De buizen worden 2-5 uur bij 37 C geïncubeerd. Daarna wordt de dichtheid van de cultuur met fysiologisch zout op de juiste waarde gebracht door de troebelheid ervan te vergelijken met een McFarland No. 0,5 standaard (de bacterieverdunning bevat dan ca. 106 kve per ml).
Beënting van de platen
De platen worden met het inoculum door middel van een wattendrager (swab) beënt. Beënt hiertoe met de eenmaal tot verzadiging bevochtigde wattendrager 4 maal één helft van de plaat door egaal over het totale oppervlak uit te strijken: Hierbij overlapt de te beënten helft steeds de vorige helft.
Laat de plaat enkele minuten drogen door het deksel er schuin op te zetten (maximaal 15 minuten)
Het opbrengen van te onderzoeken stoffen Breng de schijfjes waarin zich de te onderzoeken stoffen bevinden op de voedingsbodem met een steriele pincet of dispenser en druk ze tegen de agar aan.
Zet de plaat binnen 15 minuten na opbrengen van de stoffen in de stoof (bodem naar boven). Tenzij anders vermeld bij 37ºC en gedurende 24 uur.
Beoordeling resultaten
Meet nu met een schuifmaat de diameter van de remzone nauwkeurig. De grens is gelegen op de plaats waar met het blote oog geen duidelijke groei meer valt waar te nemen. Geïsoleerde kolonies binnen deze grens worden buiten beschouwing gelaten. Dit geldt eveneens voor latere groei binnen een oorspronkelijke remzone.
Interpretatie
De mate waarin een micro-organisme gevoelig is voor een bepaald middel is met gebruikmaking van een tabel (zie inleiding) na te gaan.Immers de mate van gevoeligheid kan men per antibioticum niet onderling vergelijken, elke stof heeft zijn eigen diffusiesnelheid en dus bij een bepaalde MIC zijn eigen specifieke remzone.Maar dan moeten wel de proefomstandigheden gestandaardiseerd geweest zijn. Omdat er zeer veel factoren van invloed zijn op zowel de diffusie van het antibioticum als de groeisnelheid van het te onderzoeken m.o. is het van groot belang alle omstandigheden en handelingen tijdens de proef zo veel als mogelijk is te standaardiseren: - De suspensie van het op te brengen micro-organisme dient altijd een concentratie van 106 per ml te hebben.
- De platen moeten een vaste dikte hebben. Incubatietijd en temperatuur dienen altijd hetzelfde te zijn.
- Een schijfje dat eenmaal met de agar in contact geweest is kan men daarna niet meer verplaatsen
Het medium moet een zodanige samenstelling hebben dat de opgebrachte antibiotica niet in hun diffusie geremd worden, voor deze bepaling zijn dan ook zijn speciale media in de handel.Gemeten wordt de zone met de complete remming zoals die met het blote of bebrilde oog zichtbaar is. Zeer kleine nauwelijks zichtbare kolonies worden niet meegerekend. Grote kolonies die midden in de remzone groeien dienen opnieuw getest en geïdentificeerd te worden. Zwermzones binnen de remzones worden niet meegerekend, Lichte groei binnen een zone kan veroorzaakt zijn door mutanten binnen een populatie, of aan de aanwezigheid van een andere soort, men zal dan opnieuw moeten reinkweken , identificeren en gevoeligheid bepalen (naar boven)De bepaling van de (aanwezigheid en de) concentratie van antimicrobe stoffen. Of er een groeiremmende stof aanwezig is in een vloeistof (lichaamsvloeistof van een patiënt , melk,) of vaste stof (kaas, vlees) kan bepaald worden met de volgende methoden:
Let op! De namen zijn hetzelfde en de methoden lijken veel op elkaar dat maakt het erg verwarrend!
De verdunningsmethode
De verdunningsmethode Bij deze methode maakt men een concentratiereeks van het te bepalen antbioticum (ijkreeks) en een verdunningsreeks van het te bepalen monster. Aan beide reeksen wordt een gevoelig micro-organisme toegevoegd en na incubatie wordt van de ijkreeks de MIC vastgesteld. Van de verdunningsreeks van het monster wordt de hoogste verdunning vastgesteld waarbij nog groeiremming plaatsvindt. In deze verdunning moet dan (als het dezelfde remmende stof betreft) ongeveer dezelfde concentratie zijn als de MIC die met de ijkreeks is vastgesteld. Op deze wijze kan men na terugrekenen naar het geconcentreerde monster de concentratie groeiremmende stof in het monster te weten komen.
(naar boven)
Agardiffusiemethode
Ook bij deze methode worden de resultaten van een ijkreeks vergeleken met de resultaten van een verdunningsreeks van het te bepalen monster.
De ijkreeks
Van een concentratiereeks van het te bepalen antibioticum wordt de (een vaste hoeveelheid) vloeistof met behulp van papieren schijfjes of in gaatjes in de agar op een egaal met een gevoelig micro-organisme. beënte plaat in contact gebracht.
De verdunningsreeks van het monster
Van de verdunningsreeks van het te bepalen monster wordt op dezelfde wijze vloeistof op papieren schijfjes of in gaatjes gebracht; hiervoor wordt dezelfde plaat gebruikt als van de ijkreeks. Na incubatie worden alle remzones opgemeten. Van de ijkreeks wordt een ijklijn gemaakt. Dit zal een rechte lijn opleveren als de logaritme van de concentratie tegen de diameter van de remzone wordt uitgezet. Vervolgens wordt de diameter van de remzone veroorzaakt door het monster (of een verdunning ervan)in deze ijklijn opgezocht en de bijbehorende concentratie afgelezen.
(naar boven)
De groeiremmingstest
Een veel gebruikte snelle methode om de aanwezigheid van groeiremmende stoffen in melk op te sporen is de Delvotest. Deze heeft vooral als doel penicilline in melk te bepalen, maar ook andere stoffen waarvoor het testorganisme, Bacillus stearothermophilus gevoelig voor is worden aangetoond. Dit is geen bezwaar, groeiremmende stoffen horen niet thuis in melk, er kan dan geen kaas van worden gemaakt , ook zijn er consumenten die overgevoelig zijn voor deze antibiotica . Bovendien wordt het antibioticum onnodig blootgesteld aan diverse milieus waarin andere micro-organismen voorkomen ; daardoor kan zich resistentie ontwikkelen.
Nu de test zelf:
Als men Bacillus stearothermophilus in een medium met een vergistbare suiker en een pH-indicator laat groeien bij 60C dan zal binnen 3 uur een kleuromslag zichtbaar worden. Voegt men echter een monster toe waarin zich een groeiremmende stof bevindt dan zal deze groei en dus de kleuromslag uitblijven of vertraagd worden. Sinds kort is deze test ook geschikt om antibiotica in vlees aan te tonen: dit gebeurt nu nog door de agardiffusietest, waarbij men in de nier van het slachtdier een papieren schijfje vocht laat opzuigen en vervolgens dit schijfje op een beënte plaat brengt. Deze test is bewerkelijker en tijdrovender dan de Delvotest.
naar boven
