Vaak bevatten monsters te kleine hoeveelheden DNA om direct mee te werken. Dankzij de PCR-techniek kunnen we nu het DNA in een monster vermenigvuldigen. Het PCR apparaat is eigenlijk niets meer dan een heel nauwkeurig verwarmings- en koelapparaat met daarin de buisjes met het DNAmonster en andere ingrediënten die noodzakelijk zijn voor de reactie.
Deze ingrediënten zijn
- losse nucleotides (A's, T's C's and G's),
- korte enkelstrengs DNA moleculen de zogenaamde primers
- Een enzym met de naam Thermus aquaticus polymerase (Taq polymerase). Taq polymerase is afkomstig van bacteriën die leven in hete bronnen en in het bezit zijn van enzymen die bij zeer hoge temperaturen werkzaam zijn.
Het proces begint met het verwarmen van het monster tot een temperatuur van ca 90-95ºC, waardoor elke dubbele streng DNA zich splitst in twee enkele strengen.
( Oorzaak: de waterstofbruggen die de complementaire strengen "bij elkaar houden" zijn veel zwakker dan de covalente bindingen tussen de nucleotides binnen een keten. Het verhitten verbreekt de waterstofbinding waardoor de dubbele streng uit elkaar gaat terwijl de covalente (keten)bindingen onaangetast blijven.
Vervolgens wordt de temperatuur iets verlaagd, wat de DNA-primers in staat stelt zich aan de gescheiden ketens te binden. De primers binden zich omdat ze complementair zijn aan bepaalde (specifieke) volgordes van elke streng die naast het DNA-stuk liggen dat moet worden gerepliceerd. Zodra de primer zich gehecht heeft gaat het Taq polymerase het DNA verlengen waarbij de losse nucleotides gebruikt worden. Het uiteindelijke resultaat is een complementaire keten op elk oorspronkelijke enkele keten. In deze eerste cyclus is het oorspronkelijk aanwezige DNA verdubbeld. In de volgende cyclus wordt opnieuw verhit en afgekoeld waardoor de nieuwe dubbele strengen gescheiden worden en elk afzonderlijk gekopieerd door het Taq polymerase. In elke stap, cyclus, wordt het aantal strengen van het gewenste stuk DNA verdubbeld. Na ongeveer 30 cycli (wat enkele uren duurt), zijn er genoeg DNA kopieën voor verder onderzoek aanwezig.
Een nieuwere methode waarbij tijdens de PCR het DNA al kan worden aangetoond is de real time PCR methode , Het vermeerderen van DNA gebeurt met behulp van primer-probes. Primers met een "label" dat pas zichtbaar wordt de primer probe wordt gebruikt : het label komt vrij er wordt licht van een bepaalde golflengte uitgezonden. Hoe meer DNA wordt omgezet hoe groter het signaal. Het verloop in de tijd wordt in een exponentiele grafiek vastgelegd . UIt de grafiek kan worden berekend hoeveel DNA er in het begin aanwezig was (hoe meer in het begin, hoe sneller de detectiegrens wordt bereikt) . Dit is een snelle methode om micro-organismen op te sporen.
Een echte aanrader: Je kunt zelf op je computer ook een PCR uitvoeren:
zie Digitaal lesmateriaal Microbiologie :: Webquests > Bacterie ID met PCR
een goede voorbereiding op het labwerk zelf, je begrijpt de principes en je ziet ool de valkuilen van de bepaling
meer DNA : DNA DNA sequensing DNA typering 16S rRNA
