Bij de microscopische tellingen zie je alle (dode en levende cellen )direct terwijl ze telt.
Behalve deze directe of microscopische totaaltellingen kun je de concentratie cellen ook langs een omweg bepalen: indirecte totaaltellingen.
Coulter Counter Troebelheid meten Troebelheid vergelijken Wegen Bepalen celcomponent Bepaling stofwisselingsproduct
Coulter Counter
De Coulter Counter is een apparaat dat het aantal deeltjes (in een bepaald volume) registreert.
Het hart van het apparaat bestaat uit een kleine ruimte met daarin een membraan waarin zich een kleine porie bevindt. Over de membraan heerst een potentiaalverschil, dat continue gemeten wordt en te zien is op een beeldscherm. Men laat vervolgens een monster passeren, d.w.z. de te tellen cellen verdund in een geleidende vloeistof. De deeltjes = cellen passeren 1 voor 1 de membraan door de porie. Bevindt zich een deeltje in de porie dan wordt het potentiaalverschil heel even verhoogd; er is een pulsje te zien op het beeldscherm, daarnaast telt het apparaat ook de hoeveelheid pulsjes.
De oorzaak van een pulsje is het feit dat een cel een hogere weerstand heeft dan de vloeistof waarin het zich bevindt. Een hogere weerstand leidt tot een hoger potentiaalverschil.
Zo is er zelfs een verband tussen de grootte van het deeltje en de hoogte van het pulsje, waardoor het mogelijk is door het instellen van een benedengrens en een bovengrens aan de afmetingen van de te tellen pulsjes om alleen cellen van een bepaalde grootte te tellen.
Het is een zeer snelle, nauwkeurige methode.
Een nadeel van de methode is dat de deeltjes niet echt gezien worden, stofdeeltjes en andere troep kunnen ook als deeltje meegeteld worden. De Coulter Counter wordt dan ook gebruikt voor grote aantallen vergelijkbare monsters zoals bij bloed- en melkonderzoek.
Bij natuurkunde praktijk (Friesland College Laboratoriumtechniek)ga je ermee aan het werk.
De meting van de troebeling van een suspensie (turbidimetrie)
Hoe meer cellen (deeltjes) in een vloeistof hoe troebeler de vloeistof is. Van deze eigenschap kan men gebruik maken om d.m.v. de troebelheidsmeting te bepalen hoeveel micro-organismen er per ml in een vloeistof zitten. Deze troebelheidsmeting voert men uit in een spectrofotometer door bij een bepaalde golflengte de extinctie (absorptie) te meten. Hoe meer cellen hoe meer licht wordt verstrooid en hoe minder licht wordt gemeten (d.w.z. hogere extinctie). Als blanco dient de vloeistof waarmee de suspensie is gemaakt of het medium waarin de cellen zijn gegroeid. Tot een bepaalde concentratie cellen is er een rechtlijnig verband tussen de extinctie en het aantal cellen per ml. Deze methode heeft als voordeel dat het een zeer snelle methode is, een nadeel is dat de methode alleen gebruikt kan worden voor (suspensies van) reinculturen. Toch komt het wel voor dat men op een lab van een reincultuur wil weten wat de concentratie cellen is. Van zo"n bekende (!) reincultuur moet je dan in een eerder stadium al eens een ijklijn gemaakt hebben om bovengenoemd verband vast te leggen. Heb je eenmaal deze ijklijn dan is een enkele meting voldoende om vast te stellen hoeveel (dode en levende) cellen er per ml aanwezig zijn.
Het maken van de ijklijn
Om van een bepaald micro-organisme het verband tussen extinctie en concentratie cellen te weten te komen moet men van deze cultuur van een aantal concentraties telkens twee metingen uitvoeren: een extinctiemeting en een andere meting bijvoorbeeld een van de bovengenoemde andere totaaltellingen.
Wil men van een cultuur graag het verband tussen extinctie en het aantal levende cellen per ml weten, wat vaak veel interessanter is, omdat de levende cellen gebruikt kunnen worden voor allerlei onderzoek, dan zal bij de ijklijn naast de extinctiemeting een levendtelling moeten worden uitgevoerd. Wil men deze ijklijn gebruiken bij een latere absorptiemeting om snel het aantal levende cellen per ml te weten te komen dan is het heel belangrijk dat de cultuuromstandigheden van de te onderzoeken reincultuur exact hetzelfde zijn als die van de ijklijn. Zo weet je vrijwel zeker dat het % levende cellen in de cultuur vergelijkbaar is (je telt met de extinctiemeting immers de levende en de dode, terwijl je alleen in de levende geïnteresseerd bent).
De McFarlandschaal
Een snelle manier waarbij geen instrument nodig is om de troebelingsgraad van een cultuur vast te stellen is de suspensie te vergelijken met een reeks standaardbuizen met een bepaalde oplopende troebelingsgraad. Dit wordt de McFarlandschaal genoemd. Deze buizen kan men zelf maken maar zijn ook kant en klaar te koop.
Andere indirecte bepalingen om het aantal cellen vast te stellen
Soms gebruikt men andere methoden om de hoeveel celmateriaal vast te stellen in plaats van een meting van het aantal cellen. Deze worden hieronder besproken:
Bepaling gewicht
Het is mogelijk om van een cultuur na verwijdering van de vloeistof het gewicht te bepalen. De vloeistof raakt men kwijt door filtratie van de suspensie (of cultuur) of door centrifugeren. Na centrifugeren liggen de cellen zeer compact op de bodem van de buis, de zogenaamde pellet. Het is dan zelfs mogelijk de buis op de kop te houden en de bovenstaande vloeistof de zogenaamde supernatant af te gieten zonder dat de pellet meegaat!
Na afloop van filtratie weegt men het filtertje samen met de daarop liggende cellen. Na afloop van het centrifugeren weegt men de buis samen met de pellet. Na aftrek van respectievelijk gewicht filtertje of gewicht centrifugebuis heb je dan het zogenaamde versgewicht te pakken.
Wil men liever het drooggewicht te weten komen dan dienen filter en buis met bijbehorende cellen zolang gedroogd te worden totdat al het water verdwenen is en het gewicht constant blijft.
Bepaling celcomponent
Een andere manier om een idee te krijgen van de hoeveelheid celmateriaal is een chemische bepaling van een celcomponent. Deze celcomponent moet uiteraard wel een goede maat zijn, bijvoorbeeld een eiwitbepaling of een stikstofbepaling, deze stoffen komen in een vrij constant % in de bacteriecel voor.
Bepaling antigenen
Een speciaal geval vormen de antigenen die zich op flagel en celwand bevinden. Ook hiervan kan men de hoeveelheid bepalen , zelfs zeer specifiek! Deze bepalingen gebeuren bij ons op school (Friesland College, Laboratoriumtechniek) tijdens de de studie-eenheid Belle en het Beest)
Bepaling DNA
De bepaling die de toekomst heeft is de DNA bepaling: voordeel is dat je heel specifiek het voor de gezochte bacterie kenmerkende stuk DNA kunt bepalen. Dit kan met de real time PCR methode
Bepaling stofwisselingsproduct
Soms kan de hoeveelheid (aanwezigheid) van een bepaalde door het micro-organisme gemaakte stof een maat zijn voor het aantal cellen. Bijvoorbeeld de hoeveelheid gevormd zuur.
Een ander stofwisselingsproduct is bacterietoxine. Dit toxine is in sommige praktijkgevallen nog belangrijker dan het aantal cellen. Zo kunnen cellen allang dood en gelyseerd zijn, terwijl het toxine nog aanwezig is en zal het levensmiddel waarin het toxine zich bevindt bij consumptie een gevaar voor de consument kunnen zijn. Omdat toxinen goede antigenen zijn worden ze meestal ook immunochemisch bepaald
