Opgaven bij de bepaling van het aantal micro-organismen. Leg ook verbanden met het practicum en de projectblokken, en gebruik als naslagwerk Microbiologie Technieken.
De nummering slaat op de paragrafen in de reader. Je kunt ook even klikken naar het onderwerp.

Bij 1.1 Waarom is deze leerstof zinvol?

vr.1 Waarom wordt in het ene geval onderzocht of er een micro-organisme aanwezig is en wordt in het andere geval geteld hoeveel micro-organismen er zijn

vr 2 Welke redenen kunnen er zijn om het aantal micro-organismen ergens in of op te bepalen? Bedenk zelf zoveel mogelijk voorbeelden.

Vr 3 Stel dat je in urine bij een onderzoek naar blaasontsteking een bepaald micro-organisme aantreft : mag je zeggen dat dit micro-organisme de oorzaak is van de blaasontsteking?

Bij 1.2.Onderscheid totaaltellingen en levendtellingen

vr1 Wat is het verschil tussen een totaaltelling en een levendtelling?

vr2 Wat verstaat men in de praktijk onder levende micro-organismen ?

vr3 Wat verstaat men in de praktijk onder dode micro-organismen ?

Bij 2.Methoden totaaltellingen

Bij 2.1.1.Telling volgens Breed

vr1 Welke gegevens zijn nodig bij de telling van Breed om het aantal micro-organisme per ml uit te kunnen rekenen?

vr2 Van een monster melk wordt 0.01 ml uitgestreken op 4 cm2 en na kleuring onder de microscoop bekeken.
De diameter van het microscoopveld is 0,20 mm. Men telt 1 cel per veld. Hoeveel micro-organismen zijn er per ml aanwezig? Antwoord?

vr3 Uit het antwoord van de vorige vraag kun je afleiden vanaf welke concentratie micro-organismen de telling van Breed te gebruiken is. Vind je dit een gevoelige methode?

vr 4 Van een monster melk wordt 0.02 ml uitgestreken op 4 cm2 en na kleuring onder de microscoop bekeken. 
De diameter van het microscoopveld is 0,20 mm. Men telt 10 cellen per veld. Hoeveel micro-organismen zijn er per ml aanwezig?Antwoord/?

2.1.2. Telling met behulp van een telkamertje

vr5 Welke gegevens zijn nodig bij de telling m.b.v. een telkamertje om het aantal micro-organismen per ml uit te kunnen rekenen?

vr6 In een telkamer met een diepte van 0,1 mm en vierkante hokjes met zijden van 0,05 mm wordt een gistsuspensie gebracht.
Men telt gemiddeld 18 gisten per hokje. Hoeveel gisten zijn er dan in 1 ml? Antwoord?

vr7 Hieronder staat een telkamer afgebeeld met daarin bacteriën. Veel bacteriën liggen op een rand van een vakje. Hoe ga je bij het tellen te werk om te voorkomen dat je deze cellen dubbel telt?

vr8 Een monster melk wordt in een telkamer gebracht en na onder de microscoop bekeken.
Men telt 1 cel per vierkantje met zijden van 0.05 mm. Hoeveel micro-organismen zijn er per ml aanwezig? Antwoord?

vr9 Uit het antwoord van de vorige vraag kun je afleiden vanaf welke concentratie micro-organismen de telling m.b.v. een telkamer te gebruiken is. Vind je dit een gevoelige methode?

vr10 Als je de Breedtelling vergelijkt met de telkamermethode voor de telling van een levensmiddel wat is het voordeel van de Breedtelling?

2.2.1. Coulter Counter

vr1 Leg uit hoe een Coulter Counter cellen kan tellen: denk hierbij aan de bouw en de werking.

Bespreek voordelen en nadelen van deze methode.

Welke toepassingen kent deze methode?

2.2.2.Troebeling (in combinatie met vorige onderwerpen)

vr1 In welke situatie is het handig of nodig om de troebelheid van een cultuur te bepalen?

Vr2 Bespreek uitgebreid op welke wijze je het verband tussen de extinctie en het totale aantal cellen per ml van een gistsuspensie kunt bepalen, je hebt alleen pfz, glaswerk ,een brokje persgist, een telkamer, en een spectrofotometer en water tot je beschikking.

2.2.3 Andere indirecte bepalingen en vorige onderwerpen)

Vr1 Hoe kun je bepalen hoeveel (dode + levende) bacteriecellen van bijvoorbeeld Escherichia coli er in een gram gaan?

Vr2 Naast het wegen van micro-organismen zijn er nog meer methoden om het totale aantal cellen per ml te bepalen? Zet alle methoden voor een totaaltelling nog eens op een rijtje. Bespreek de voordelen en de nadelen.

Vr3 Welke stoffen in de bacteriecel zijn een goede maatstaf voor het aantal cellen ( de hoeveelheid celmateriaal)?

Vr4 In welke gevallen kan men deze (in vraag 2 behandelde) bepalingen toepassen?

a: aantal micro-organismen in een slagroompunt

b: aantal micro-organismen in een bacteriesuspensie

c: bepaling micro-organismen in oppervlaktewater

vr5 Wat is het voordeel van een McFarlandschaal boven een spectrofotometer?

Vr6 In welke gevallen bepaalt men liever het toxine als de bacterie die tot deze toxinen vormt?

Vr7 Wat is het voordeel van een immunochemiche bepaling?

Bij 3.Methoden levendtellingen : voorbereidingen, kiemgetal, MPN

Vr1 Wat is een algemene voedingsbodem? Noem een voorbeeld uit de praktijk(les).

vr2 Wat is een selectieve voedingsbodem? Noem twee voorbeelden uit de praktijk(les) en leg de werking uit.

vr3 Wat is een electieve voedingsbodem? Noem twee voorbeelden uit de praktijk(les) en leg de werking uit.

vr4 Waarom worden er op een lab voor de bepaling van het kiemgetal zowel algemene als selectieve media gebruikt?

vr5 Noem alle voorbereidingen die nodig zijn voordat het kiemgetal kan worden bepaald van een kroket.

vr6 Waarom is schudden zo belangrijk bij bepalingen van het aantal micro-organismen? Wat is meestal het gevolg vanslecht of niet schudden voor de uitslag van de bepaling?

vr7 Wat is een stomacher? Wat is de functie ervan (wat doet hij met het monster?)

vr8 Van een monster water wordt m.b.v. de mengplaatmethode(1 ml per plaat) een zogenaamd aeroob kiemgetal ingezet.Omdat er veel bacteriën verwacht worden worden er hoge verdunningen ingezet.

De resultaten zijn als volgt:

 

Verdunning

Aantal kolonies plaat1

Aantal kolonies

plaat 2

10.000 x

2400

1800

100.000x

390

320

1000.000x

53

51

10.000.000x

4

3

Proefomstandigheden:

medium:Plate Count Agar,mengplaat (1ml per plaat),aerobe incubatie

incubatietemperatuur:30 C

incubatietijd:48 uur

Vragen:

a.Welke micro-organismen worden hier precies geteld?

b.Waarom mag je in dit geval de 10.000 x verdunning ook wel 10-4 noemen ?

c.Maak een werkschema:wat is er allemaal nodig voor de bepaling? denk aan aantal pipetten, aantal buizen en flesjes pfz, hoeveelheid medium.

d.Wat is het aeroob kiemgetal? Geef berekeningen en verklaar. Antwoord?

vr9 Achteraf blijkt de analist van opgave 8 een vergissing gemaakt te hebben:in plaats van 1 ml heeft hij telkens 0,1 ml in de platen gepipetteerd.(De verdunningen zijn wel op de juiste wijze aangelegd).Hij komt na het maken van de mengplaten achter zijn vergissing en zet de platen wel in de stoof.

Vragen:

a.Wat is onder deze omstandigheden het kiemgetal?dus uitgaande van de hier beschreven vergissing en de in opgave 1 genoemde resultaten. Antwoord?

b.Mag je nu de 10.000 keer verdunning ook 10 -4 noemen?

(het gebeurt vaak wel, maar wat is er zo verwarrend aan in het laatste voorbeeld?)

vr10 Hoe kun je op vaste voedingsmedia toch grote hoeveelheden vloeibaar monster onderzoeken? beschrijf en leg uit.

Welke beperkingen kent deze methode? Verklaar.

vr11 Van een overnachtcultuur schat men dat het aantal micro-organismen per ml 109 bedraagt.

Men wil het kiemgetal bepalen : welke verdunningen moet men aanleggen ? Wat is er allemaal nodig, maak een kiemplaatschema.

vr12 In schepijs mogen niet meer dan 104 coliforme k.v.e's per ml aanwezig zijn. Hierop wordt het ijs onderzocht: dus men gaat onderzoeken of er niet meer dan 104 k.v.e.'s aanwezig zijn. Hiervoor hoeft men maar één verdunning in te zetten! Welke? beredeneer dit, ga hierbij uit van de mengplaatmethode.

vr13 In welke gevallen wordt de membraanfiltermethode gebruikt?

vr14 Vergelijk de gietplaat en de strijkplaatmethode met elkaar: noem van beide de voordelen en de nadelen.

vr15 Waarom spreekt men bij de uitslag van een kiemgetal liever van kolonievormende eenheden dan van micro-organismen?

vr16 Vergelijk de swabmethode en de afdrukmethode met elkaar, noem de voordelen en de nadelen.

vr17 Welke monsters worden op het lab met de MPN-methode bepaald? Wat is hier de reden voor?

vr18 Van het bovengenoemde watermonster met het kiemgetal berekend bij vr 9 wordt een MPN bepaling uitgevoerd.

Vragen:

a.Welke drie verdunningen worden in dit concrete geval bij voorkeur ingezet?Waarom?

Welke verdunningen hoefden (achteraf gezien) niet ingezet te worden?

Maak ter verduidelijking een inzetschema van de proef(met namen en hoeveelheden).

Weet je ook een geschikt medium?Waarom is dit medium zo geschikt?

b.Als de door jou onder 3a genoemde verdunningen van laag neer hoog bij het in drievoud inzetten van 1 ml het volgende resultaat te zien geven:

laagste verdunning 3 troebele buizen

middelste verdunning 1 troebele buis

hoogste verdunning 0 troebele buizen

Wat is dan ongeveer het aantal coliformen per ml? Beredeneer ja antwoord op grond van de troebele en heldere buizen. Er komt geen tabel aan te pas!

c.Met een tabel kan men het MPN van een monster wat nauwkeuriger bepalen.

Waar is MPN de afkorting van?

Wat betekent dat?

Wat is het MPN van bovengenoemd monster?

vr19 Van een monster wordt van de 1:100, 1:1000 en 1:10.000 verdunning in drievoud 1 ml ingezet op vloeibaar medium.

Het resultaat is:

1:100 : 2 positieve buizen

1:1000 : 1 positieve buis

1:10.000: 0 positieve buizen

Wat is de MPN? Anwoord?

vr20 In een monster zitten vermoedelijk 10.000 micro-organismen per ml. Welke verdunningen moeten dan bij de MPN worden ingezet om een goed resultaat te kunnen aflezen in de tabel? of zonder tabel een schatting te kunnen maken?

vr21 Vergelijk de verdunningsmethode (MPN-methode) met de meng- of strijkplaatmethode : denk aan bewerkelijkheid en gevoeligheid.

Bij 3.5. Indirecte bepaling van het aantal levende micro-organismen

vr1 Bij de ATP bepaling wordt de hoeveelheid licht gemeten. Hoe wordt dit licht gevormd? :

Geef een reactievergelijking ( geen structuurformules, maar namen van de reagentia) waarin vermeld staat wat er allemaal nodig is voor de vorming van dit licht.

vr2 Wat is zijn twee uitgesproken voordelen van deze methode?

vr3 Wat zijn de twee nadelen? Zijn beide nadelen even "erg" ? zijn er ook argumenten om het ene nadeel juist een voordeel te noemen?

vr4 Wat zijn de voordelem van de impediometrie (bv. bactometer) vergeleken met de klassieke telplaatmethode?

vr5 Welke voorbereidingen moet men eerst hebbem uitgevoerd voordat men een bactometer routinematig voor een bepaald monster en een bepaald micro-organisme kan inzetten?

Over de de hele module:

vr1 Wat zijn van beide microscopische methoden de nadelen vergeleken met een niet-microscopische totaaltelling?

vr2 Zijn er ook voordelen vergeleken met een niet-microscopische totaaltelling?

vr3 Wat zijn de voordelen van een totaaltelling boven een kiemgetal of MPN methode?

vr4 Men heeft een telkamertje met een diepte van 0,1mm en vierkante telhokjes met zijden van 0,05 mm. Per hokje treft men gemiddeld 12 gisten aan. Hoeveel gisten zijn er per ml aanwezig?

vr5 Van bovengenoemde gistsuspensie wil men het kiemgetal bepalen. Welke verdunningen zal men kiezen? Hoe kun je na telling van het aantal kolonies uitrekenen wat het % levende gistcellen in het monster was? Geef een getallenvoorbeeld, bijvoorbeeld hoeveel kolonies je aantreft in de door jou uitgerekende ideale verdunning als 80% van de gisten in leven is.

vr6 In bijna alle gevallen gebruikt men als verdunningsvloeistof een vloeistof waarin NaCl is opgelost. Wat is de reden hiervoor?

vr7 In veel gevallen wil men graag op het moment zelf weten hoeveel levende cellen er (per ml) in een cultuur zitten of er in ieder geval een schatting van kunnen maken.

Vraag a. In welke gevallen is dat zo?

Het probleem is dat de uitslag van een levendtelling bijna nooit direct bekend is :

Vraag b. Waarom niet?

Als de uitslag dan eindelijk wel bekend is is de te bepalen cultuur al weer zoveel ouder dat de kans groot is dat het aantal levende cellen per ml sterk gedaald is en weet men dus nog niets.

Daarom is het nodig het verband tussen kiemgetal en de uitslag van een directe methode te weten, zie PVB proeven. Hieronder een getallenvoorbeeld.

Een 24 uur oude gistcultuur in moutextractbouillon wordt onderzocht op het aantal levende cellen door er een kiemgetal van te bepalen:

Men onderzoekt de 10-4, 10-5 en 10-6verdunning en vindt de volgende aantallen kolonies op mengplaten moutagar (30 C):

Verdunning

Aantal kolonies

10-4

850 en 900

10-5

120 en 132

10-6

10 en 14

Vraag cWat is het kiemgetal?

Vervolg op volgende bladzijde!!!!

Van dezelfde cultuur wordt tegelijk met het inzetten van het kiemgetal een tweevoudige verdunningsreeks gemaakt en van elke verdunning de extinctie gemeten.

De resultaten zijn als volgt:

Verdunningen in moutbouillon

Extinctie bij 620 nm

onverdunde cultuur

2,6

2 *

2,6

4 *

2,4

8 *

1,2

16 *

0,6

32 *

0,3

Vraag d.Waarom wordt er nu verdund in moutextractbouillon en niet met pepton-fysiologisch zout?

Vraag e.Maak een grafiek die voor dit micro-organisme onder deze kweekomstandigheden het verband aangeeft tussen absorptie en het aantal levende cellen.

Een volgende keer vindt je bij een eveneens 24 uur oude gistcultuur een extinctie van 2,0 bij een 4 X verdunde cultuur.

Vraag f.Hoeveel levende cellen zijn er dan aanwezig?

Vraag g.Welke verdunningen moet je aanleggen voor een proef waarbij je 104 levende cellen per ml nodig hebt?